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Gazeilles, Leïla. Analyse fonctionnelle des différentes isoformes codées par le gène Dermokine

Gazeilles, Leïla (2010) Analyse fonctionnelle des différentes isoformes codées par le gène Dermokine.

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Résumé en francais

La fonction de barrière de l'épiderme est assurée par sa partie la plus superficielle, la couche cornée constituée de cornéocytes, cellules très inter-cohésives, entourées d'un milieu extracellulaire riche en lipides. Les cornéocytes résultent de la cornification, une mort cellulaire programmée particulière. Les éléments constitutifs de ces cellules et de leur milieu sont donc principalement synthétisés par la couche vivante sous-jacente constituée de kératinocytes granuleux. De façon surprenante, un des transcrits les plus abondants de cette assise épidermique code pour une protéine de fonction inconnue, la dermokine (DMKN). DMKN subit un épissage alternatif complexe, aboutissant à la production de quatre types d'isoformes : delta, qui est intracellulaire et ubiquiste, alpha, qui est sécrétée et exprimée dans tout l'épiderme, ainsi que béta et gamma, qui sont sécrétées et dont l'expression est restreinte à la couche granuleuse de l'épiderme. La séquence de ces isoformes ne permettant pas, par analyse bioinformatique, de prédire leur fonction, nous avons développé la méthode de double hybride chez la levure pour rechercher des partenaires potentiels. Nous avons identifié la petite GTPase Rab5 comme partenaire de la forme intracellulaire DMKNdelta. Rab5 est principalement localisée au niveau des endosomes précoces et participe au trafic endomembranaire. Elle présente deux conformations : liée au GTP (état actif) ou liée au GDP (état inactif). L'interaction de DMKNdelta avec les formes actives et inactives de Rab5 a été confirmée in vitro par des expériences de « GST pull-down ». In vivo, DMKNdelta colocalise majoritairement avec la forme inactive de Rab5. De plus, l'expression de DMKNdelta en fusion avec la GFP dans les cellules HeLa induit la formation de vésicules dans lesquelles elle colocalise partiellement avec Rab5 endogène et avec la clathrine, suggérant l'implication de DMKNdelta dans les étapes précoces de l'endocytose. Enfin, nous avons montré que DMKNdelta favorise la liaison de la petite GTPase au GTP et donc son activation, et qu'elle stimule l'endocytose de la transferrine. Ce travail montre que la DMKNdelta active Rab5 et joue un rôle dans l'endocytose précoce. Dans l'épiderme hyperprolifératif comme, par exemple, dans les lésions psoriasiques ou l’épiderme cicatriciel de souris, l’expression des DMKNbéta/gamma n'est plus restreinte aux seuls kératinocytes granuleux mais s'étend à un nombre accru d'assises suprabasales. Ces résultats, associés à l'augmentation du taux des transcrits DMKNbéta/gamma après irradiation de cellules HaCaT par rayonnement UVB, suggèrent un rôle pour ces protéines dans la fonction de barrière de l'épiderme. En outre, nous avons mis en évidence par double hybride chez la levure, et confirmé par « GST pull-down », une interaction entre le domaine riche en glycine et sérine des DMKNdelta/gamma et le domaine non lectine de la galectine-3. Cette lectine animale ubiquiste et pléiotrope peut être sécrétée par une voie non classique. Dans le milieu extracellulaire, elle interagit avec de nombreuses protéines de la matrice, via son domaine lectine et sa partie N-terminale. L'analyse immunohistologique de coupes de peau humaine montre que la galectine-3 est fortement exprimée dans la couche granuleuse, où elle colocalise avec les DMKNdelta/gamma. Le rôle de la galectine-3 dans l'épiderme est encore mal connu. L'existence d'un réseau de protéines extracellulaires, impliquant entre autres DMKNdelta/gamma ainsi que la galectine-3, pourrait jouer un rôle, encore largement inexploré, dans les étapes tardives de la différenciation épidermique. En effet, nous avons mis en évidence par PCR quantitative en temps réel que certains gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire sont transcrits, et donc potentiellement traduits, dans les couches suprabasales de l'épiderme humain. La poursuite de la caractérisation fonctionnelle des DMKNdelta/gamma dans l'espace extracellulaire des couches granuleuse et cornée s'appuiera entre autre sur un modèle de souris invalidées pour le gène Dmkn que nous avons récemment obtenu.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Guerrin Weber, Marina
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Unité de Différenciation Epidermique et Auto-immunité Rhumatoïde (UDEAR), UMR 5165
Mots-clés libres :Epiderme - Différenciation - Kératinocyte - Dermokine - Rab-5 - Galectine-3 - Endocytose - Matrice extracellulaire
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :28 Nov 2011 10:32