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Iordanov, Iordan. Structure and dynamics of the outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae: a joint NMR–SMFS–proteolysis and MS approach

Iordanov, Iordan (2012) Structure and dynamics of the outer membrane protein A from Klebsiella pneumoniae: a joint NMR–SMFS–proteolysis and MS approach.

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Résumé en francais

KpOmpA est une protéine de la membrane externe de K. pneumoniae. Elle fait partie de la famille des "outer membrane protein A", OmpA. KpOmpA est une protéine constituée de deux domaines: un domaine transmembranaire structuré en tonneau ß et une partie soluble, périplasmique. Le domaine transmembranaire de KpOmpA présente une homologie importante avec celle d'OmpA d'E. coli dont la structure a été déterminée par cristallographie aux rayons X et spectroscopie RMN. OmpA d'E. coli est responsable lors de la formation de biofilm. Elle a un rôle d'adhésine et d'invasine. Elle est la cible préférentielle du système immunitaire et est le récepteur de bactériophages. Il est admis que la plupart de ces fonctions sont dues aux boucles extracellulaires de ces protéines. Les différences majeures entre les protéines KpOmpA et OmpA d'E. coli concernent les boucles extracellulaires de longueur plus importante dans le cas de KpOmpA. Elles jouent un rôle important au cours de l'activation des macrophages et des cellules dendritiques par la voie des récepteurs TLR2. Les boucles extracellulaires jouent un rôle essentiel au cours de l'activation du système immunitaire. Mieux définir la structure et la dynamique de ces boucles est d'une importance essentielle afin de mieux appréhender la fonctionnalité des boucles extracellulaires de KpOmpA. Les informations structurales connues actuellement (structure RMN déterminée dans le groupe IPBS RMN en 2009) ont été obtenus jusqu'à présent avec des échantillons de protéines recombinantes purifiées et repliées dans des micelles de détergent. Dans le présent travail, nous avons d'abord établi un protocole de reconstitution de la protéine dans une membrane phospholipidique et caractérisé nos échantillons par microscopie électronique. Des expériences de spectroscopie de force atomique sur molécule unique ont été réalisées pour caractériser le repliement de la protéine dans son environnement membranaire. Ces expériences suggèrent un nouveau rôle de KpOmpA au sein même de la membrane (collaboration D. Müller, ETH Zürich). Le domaine soluble périplasmique de la protéine a été exprimé indépendamment du domaine membranaire. Les premières expériences HSQC réalisées montrent une structuration de ce domaine. La structure de ce domaine par spectroscopie RMN est en cours de réalisation. Le comportement dynamique des boucles extracellulaires du domaine membranaire KpOmpA reconstitué dans des liposomes a été étudié par spectroscopie RMN à l'angle magique (MAS) et notamment par mesure des temps de relaxation. Nous avons montré que la dynamique intrinsèque de la protéine est indépendante de l'environnement (membrane vs micelle). Des expériences de protéolyse ménagée suivie par spectrométrie de masse (MALDI-TOF) ont été comparées avec les informations RMN afin d'évaluer plus précisément les niveaux de mobilité des différentes boucles extracellulaires. La préservation au cours de l'évolution des boucles extracellulaires semble lier à leur dynamique, ce qui suggère l'importance de ces boucles extracellulaires, en termes de séquence, longueur mais aussi de dynamique lors de la réponse immunitaire.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Milon, Alain
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
Mots-clés libres :Outer membrane protein A - Protein expression and purification - Protein reconstitution - Single-molecule force spectroscopy - Protein dynamics - Spin-lattice relaxation - Solution and solid-state NMR - Electron microscopy - Limited proteolysis - Mass spectroscopy
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :10 Sep 2012 09:42