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Rath, Parthasarathi. Structural and functional characterization of PorA and PorH : the two major porins from Corynebacterium glutamicum

Rath, Parthasarathi (2012). Structural and functional characterization of PorA and PorH : the two major porins from Corynebacterium glutamicum.

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Résumé en francais

PorA (5 kDa) et PorH (7kDa) sont les deux protéines membranaires majeures de la membrane externe de Corynebacterium glutamicum qui appartient au groupe supragénérique des bactéries Gram-positives contenant plusieurs agents pathogènes i.e. Mycobacterium tuberculosis, M. leprae et C. diphtheriae. Les deux protéines forment des canaux ioniques hétéromériques et présentent la particularité d'avoir une modification post-traductionnelle : estérification par l'acide mycolique. Les deux protéines ont été produites dans deux systèmes d'expression : chez C. glutamicum et dans un système acellulaire utilisant des extraits de E. coli. La présence ou l'absence de modification post-traductionnelle, sur les protéines produites in vivo et in vitro a été caractérisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. Les spectres de dichroïsme cellulaire et de RMN de PorA et PorH uniformément marquées et solubilisées en micelles de LDAO sont caractéristiques de protéines mono-disperses, partiellement structurées, et de qualité compatible avec une détermination de structure par RMN. Le test fonctionnel des protéines, par mesure de conductivité ionique après reconstitution dans une membrane lipidique (technique dite de BLM pour " black lipid membrane ") a montré que a) la modification post-traductionnelle de PorA par un acide mycolique est essentielle (contrairement à celle de PorH) b) la présence simultanée de PorA et de PorH est requise pour la formation d'un canal ionique voltage dépendant typique d'une porine. Afin de mieux comprendre l'importance de l'acide mycolique pour l'activité canal ionique, le complexe protéique PorA-PorH a été reconstitué dans son environnement naturel. Les principaux lipides de la membrane externe du C. glutamicum [Tréhalose dimycolate (TDM), tréhalose monomycolate (TMM) et cardiolipide (CL)] ont été extraits et purifiés par chromatographie d'adsorption et échange d'ions, sous forme protonée et sous forme perdeutériée. Après formation de protéoliposomes les propriétés membranaires de TDM seul ou en mélange avec CL ont été étudiées RMN du deutérium, diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique. L'insertion de PorA et PorH dans des vésicules de TDM a permis de mettre en évidence la reconstitution de l'hétéro-oligomère (contrairement aux micelles de LDAO). Ceci ouvre la voie à la détermination de structure 3D du complexe PorA-PorH fonctionnel par RMN solide et/ou liquide.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Milon, Alain
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
Mots-clés libres :Ion channels - Porins - Protein expression and purification - Cell-free expression - Mycolic acids - Solution and solid state NMR - Mass spectrometry - Black lipid membrane measurements - Electron microscopy
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :07 May 2013 14:15