LogoLogo

Fedor, Yoann. Nouveau biomarqueur en temps réel de cassures double-brin de l'ADN et génotoxicité de la cytolethal distensing toxin

Fedor, Yoann (2012). Nouveau biomarqueur en temps réel de cassures double-brin de l'ADN et génotoxicité de la cytolethal distensing toxin.

[img]
Preview
PDF - nécessite un logiciel de visualisation PDF comme GSview, Xpdf or Adobe Acrobat Reader
9Mb

Résumé en francais

L'ADN est constamment la cible de dommages, provenant aussi bien de sources endogènes (propriétés intrinsèques de la macromolécule, métabolisme cellulaire...) qu'exogènes (radiations, contaminants alimentaires...). Parmi ces dommages, les cassures double-brin de l'ADN (CDB) représentent une des lésions les plus cytotoxiques. En réponse à ce danger, la cellule dispose de voies de détection et signalisation impliquant le recrutement de protéines. Au cours de cette réponse des modifications post-traductionnelles de protéines de signalisation et de réparation sont produites au niveau du site de cassure comme, par exemple, la phosphorylation de H2AX, un variant de l'histone H2A. Cette voie de signalisation permet d'une part d'activer les points de contrôle du cycle cellulaire pour stopper la prolifération et, d'autre part, de stimuler les systèmes de réparation de CDB afin de restaurer l'intégrité de l'ADN. Une réparation infidèle des CDB peut aboutir à des additions/délétions de bases, voir des réarrangements chromosomiques, à l'origine de cancers. Ainsi, élucider les causes et les mécanismes responsables de la formation des CDB en réponse à des stress génotoxiques et suivre leur prise en charge par la cellule sont des éléments importants pour la compréhension de la génotoxicité. Des techniques permettant d'analyser la formation des CDB (immunofluorescence, électrophorèse en champs pulsé, COMET neutre...) existent, mais elles ne permettent d'analyser l'état de l'ADN qu'à un instant fixe. La première partie de mon travail de thèse a été de créer un outil innovant, permettant de détecter et suivre la formation de CDB en temps réel, sur cellules vivantes. Cet outil repose sur la technologie des nanobodies, anticorps monochaines produits uniquement chez les camélidés et certains requins. Nous avons fait exprimer un nanobody intracellulaire dirigé contre H2AX phosphorylé (appelé gammaH2AX), qui semble se relocaliser aux CDB créées par microirradiation. La création de cet outil a nécessité l'immunisation d'un lama avec le peptide phosphorylé et l'isolement/le clonage des séquences codantes des nanobodies afin de produire une banque. Les nanobodies spécifiques de gammaH2AX ont été sélectionnés par phage display et leurs séquences ont été exprimées en cellules humaines, fusionnées à un fluorophore afin d'observer leur relocalisation aux CDB en temps réel. La seconde partie de ma thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d'action d'une génotoxine bactérienne, responsable de cancers en modèle murin : la Cytolethal Distending Toxin (CDT). Cette toxine, sécrétée par des bactéries commensales et pathogènes, se localise au noyau des cellules cibles et provoque des CDB. Si le fonctionnement de cette toxine était préalablement décrit comme celui d'une nucléase produisant des CDB directes, mon travail a montré que pour des concentrations équivalentes à la Dose Létale 50, CDT produit d'abord des cassures simple-brin qui dérivent en CDB au cours de la réplication de l'ADN. De plus, la réparation de ces CDB par recombinaison homologue est cruciale pour la survie des cellules exposées à CDT. En conclusion, mon travail de thèse a permis d'une part de développer un outil innovant permettant d'analyser la dynamique en temps réel des CDB en cellules humaine et, d'autre part, d'éclaircir le mécanisme menant à la génotoxicité de CDT, toxine représentant un risque potentiellement cancérigène chez les mammifères. Les apports de ces travaux sont discutés ici.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Mirey, Gladys
Salles, Bernard
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Toxicologie Alimentaire (TOXALIM), UMR 1331
Mots-clés libres :Cassure double-brin - Signalisation des dommages - Nanobody VHH - Cytolethal distending toxin - Intrabody - Génotoxicité - Toxine bactérienne
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :28 Oct 2013 11:24