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Randrianjatovo-Gbalou, Irina. Substances exopolymériques de biofilms bactériens : quantification in situ et étude de leur rôle dans la cohésion de la matrice extracellulaire

Randrianjatovo-Gbalou, Irina (2016). Substances exopolymériques de biofilms bactériens : quantification in situ et étude de leur rôle dans la cohésion de la matrice extracellulaire.

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Résumé en francais

Les biofilms représentent une contrainte technologique dans le secteur industriel et sont à l'origine de nombreux cas d'infections chroniques dans le domaine médical. De ce fait, la compréhension des processus biologiques qui s'opèrent au sein de ces communautés microbiennes est un défi permanent. Des méthodes spécifiques, sensibles et diversifiées s'avèrent essentielles pour apporter une connaissance approfondie de l'organisation des biofilms en réponse à des facteurs environnementaux. La matrice extracellulaire qui englobe les microorganismes constitue un réseau complexe, et la description de sa composition et de sa structure constitue un enjeu majeur. Des outils de caractérisation in situ et non-destructifs des Substances ExoPolymériques (SEP) ont pu être proposés lors de ce travail de thèse : des méthodes de quantification ciblant spécifiquement chaque composant majeur de la matrice extracellulaire ont ainsi été développées et validées sur des biofilms modèles. Ces biofilms, choisis pour leur diversité en terme de matrice extracellulaire sont formés par les souches Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Bacillus licheniformis CIP 110824 et Weissella confusa LBAE-UPS C39-2. Des critères communs ont été retenus pour guider le choix des marqueurs retenus pour développer les dosages : spécificité pour la détection de toutes les formes moléculaires d'une même famille biochimique, sensibilité pour la détection de faibles quantités de polymères dans des biofilms en microplaque, et possibilité d'observation en microscopie basée sur la détection de fluorescence. Une stratégie commune a été adoptée pour la quantification des exoprotéines (ePN), exopolysaccharides (ePS) et fibres amyloïdes (FA) de la matrice et a consisté à : (i) définir une molécule standard pour calibrer le test ; (ii) analyser d'éventuelles interférences en solution ; (iii) valider la faisabilité et la fiabilité du test in situ par la méthode des ajouts dosées réalisée sur chacun des biofilms modèles. Un composé naturel pro-fluorescent, l'épicocconone, a été retenu pour la quantification des exoprotéines. Le test a montré une limite de détection de 0,2 µg par puits, sans aucune interférence significative des autres composants majeurs du biofilms (ePS, ADNe, cellules). D'autre part, les protéines sous forme amyloïdes ont pu être détectées avec la même sensibilité que les non amyloïdes par ce marqueur. Par la suite, les exopolysaccharides ont été dosés en exploitant la réaction de Schiff, et la méthode a permis d'obtenir une limite de détection de 0,3 µg par puits. Les protéines amyloïdes bactériennes (FA) ont également été quantifiées au moyen du marqueur Thioflavine T. La k-caséine a été utilisée comme étalon, après fibrillation de la protéine native in vitro. Deux types de dosages ont été développés : le dosage ex situ de FA extraites de biofilms bactériens et le dosage in situ des protéines amyloïdes au cœur des biofilms. Enfin l'ADN extracellulaire (ADNe) a également été quantifié à partir du PicoGreen(r) tout en contrôlant le temps d'exposition du marqueur avec les biofilms afin de ne marquer que l'ADN extracellulaire. Un profil quantitatif des SEP a ainsi pu être établi pour les trois souches modèles. Le second objectif du travail s'est focalisé sur la compréhension du rôle des SEP dans les propriétés d'adhérence et de cohésion du biofilm de Bacillus licheniformis, responsable de la colonisation de surfaces dans l'industrie papetière. Les outils ainsi développés ont permis d'étudier la contribution de chaque composé matriciel (ePN, ePS, FA, ADNe) dans le comportement du biofilm, en réponse à des actions enzymatiques. La combinaison de ces dosages à des observations en microscopie confocale et à des mesures de perméabilité du biofilm a alors permis de proposer une interaction possible entre les fibres amyloïdes et l'ADN extracellulaire. Ce complexe stable pourrait agir comme facteur d'adhérence et d'agrégation intercellulaire pour assurer la stabilité et la structure tridimensionnelle du biofilm.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Girbal-Neuhauser, Elisabeth
Marcato-Romain, Claire-Emmanuelle
Ecole doctorale:Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (SEVAB)
laboratoire/Unité de recherche :Laboratoire de Biotechnologies Agroalimentaire et Environnementale (LBAE), EA 4565
Mots-clés libres :Bacillus licheniformis- Quantification - In situ - Adhérence - Cohésion - Amyloïdes - ADNe
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :02 Sep 2016 15:47