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Rosazza, Christelle. Internalisation et trafic intracellulaire de l'ADN plasmidique délivré par électroporation in vivo

Rosazza, Christelle (2014). Internalisation et trafic intracellulaire de l'ADN plasmidique délivré par électroporation in vivo.

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Résumé en francais

L'électroporation est une méthode physique de délivrance de molécules dans les cellules ou tissus. Le transfert des petites molécules se déroule vraisemblablement par diffusion à travers de présumés electropores alors que le transfert d'ADN plasmidique est plus compliqué et reste à élucider. Lors de l'application des impulsions électriques, la membrane devient perméable et l'ADN est électrophorétiquement poussé vers celle-ci où il est inséré en agrégats distincts pendant une dizaine de minutes. Ensuite, l'ADN est internalisé, navigue à travers le cytoplasme jusqu'à atteindre le noyau où l'expression de l'ADN est initiée. Mon travail de thèse se concentre sur l'internalisation et le trafic intracellulaire de l'ADN, deux étapes assez peu décrites dans le cadre de l'électroporation. L'internalisation de l'ADN semble se faire majoritairement par endocytose. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de l'endocytose et de marqueurs fluorescents permet de conclure que l'endocytose médiée par la clathrine et les rafts lipidiques ainsi que la macropinocytose sont impliquées (respectivement 25%, 50% et 30%). L'endocytose semble être la principale (sinon la seule) voie par laquelle les agrégats d'ADN entrent dans les cellules. De plus amples recherches doivent être menées pour dépeindre précisément le mécanisme d'internalisation de l'ADN d'autant plus que l'endocytose médiée par les rafts lipidiques représente un large panel de possibilités (caveoline, flotilline, GEEC...). Nos résultats sont en accord avec la distribution spatiotemporelle de l'ADN observée à la membrane. Une fois dans le cytoplasme, l'ADN semble suivre le trafic endosomal classique. La colocalization en dynamique effectuée dans des cellules exprimant séparément plusieurs marqueurs d'endosomes (Rab5, Rab11, Rab9 et Lamp1) démontre que l'ADN est présent dans les endosomes précoces, de recyclages et tardifs dans des proportions calculées pour être respectivement 70%, 50% et 30%, valeurs moyennées sur l'heure qui suit l'électrotransfert. Entre 1-2 h après la délivrance, 60% de l'ADN est situé dans des structures marquées Lamp1 avec une prédominance probable des lysosomes. Ces résultats sont en accord avec l'observation de l'ADN toujours présent en agrégats dans le cytoplasme et ils renforcent l'observation d'un mécanisme d'endocytose mentionné précédemment. L'ADN dans le cytoplasme est transporté activement par les filaments d'actine et les microtubules. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques combinée au suivi de particules uniques effectué sur un grand nombre d'agrégats d'ADN clairement démontre que le cytosquelette contrôle la migration de l'ADN dans le cytoplasme. L'ADN exhibe le mouvement typique des endosomes avec des phases intermittentes de transport actif et de diffusion. Les phases de transport actif ont en moyenne une vitesse de 250 nm/s, une persistance de 6 s et engendre un déplacement de 1,3 µm. Cependant, les distributions de ces paramètres sont larges avec des vitesses allant de 50 nm/s à 3400 nm/s, des déplacements de 0,1 µm à 12 µm et des durées de 2 s à 30 s. Ces résultats confirment d'autres travaux qui présentent les microtubules comme un moyen de migration de l'ADN dans les cellules. Cela est aussi en accord avec la présence de l'ADN dans des endosomes vu que leurs membranes contiennent des protéines (probablement Rabs) capables de se lier aux moteurs moléculaires. De plus, cela explique comment les gros agrégats d'ADN peuvent traverser le cytoplasme dense et atteindre avec succès le noyau, phénomène improbable par simple diffusion. Le chemin de l'ADN que nous décrivons est efficace étant donné que la perturbation d'une étape intermédiaire entraine une réduction de l'expression génique. Bien que nos découvertes doivent être confirmées et nécessitent de plus amples investigations, la prochaine étape clé à comprendre est l'échappement supposé de l'endosome qui doit forcement se réaliser afin d'obtenir une expression de l'ADN.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Rols, Marie-Pierre
Zumbusch, Andreas
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
Mots-clés libres :Electroporation - Endocytose - Transport actif - Suivi de particule unique - Trafic endosomal - Cytosquelette - Colocalisation dynamique - ADN
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :16 Sep 2016 14:29