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Onfroy, Lauriane. Développement de biosenseurs BRET prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux

Onfroy, Lauriane (2016). Développement de biosenseurs BRET prédictifs de la cardiotoxicité des médicaments anti-tumoraux.

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Résumé en francais

Beaucoup de médicaments anticancéreux entrainent à plus ou moins long terme une cardiotoxicité, dont les mécanismes moléculaires restent encore très mal connus. Aujourd'hui, peu de moyens existent pour prédire, au stade du développement préclinique, le potentiel cardiotoxique de ces molécules. Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse a consisté à utiliser le principe de transfert d'énergie bioluminescente par résonance (BRET) pour créer des biosenseurs de l'activité des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe IB. En effet, ces protéines kinases ubiquitaires sont des cibles pharmacologiques majeures de part leur implication dans les phénomènes cancéreux, et sont également importantes pour l'homéostasie cardiaque. Ainsi, elles pourraient constituer une cible cardiaque des agents anticancéreux participant au développement de la cardiotoxicité. Les PI3K-IB sont des hétérodimères formés d'une sous-unité catalytique (C) p110y associée à une sous-unité régulatrice (R) dont il existe deux isoformes, p87 et p101. Pour développer le senseur PI3Ky, un donneur (Rluc8) et un accepteur (GFP2) d'énergie BRET ont été fusionnés en position N- ou C-terminale de chacune des sous-unités C et R (senseur intermoléculaire). Après vérification de l'expression cellulaire de ces constructions dans les cellules HEK293T, les interactions entre les différentes paires de senseurs BRET (8 combinaisons au total) C et R ont été mesurées, en temps réel dans les cellules vivantes, à la recherche d'un couple capable de refléter l'activation de la PI3K. Nos résultats démontrent des interactions spécifiques basales entre les sous-unités C et R des couples p110y-p87 et p110y-p101. Par contre, aucune des conditions de stimulations testées (nature du récepteur, concentrations de ligand, temps de stimulation, stœchiométrie des senseurs) n'a permis de détecter des modulations du signal BRET. La présence de co-activateurs connus de la PI3Ky tels que les protéines Ras ou les protéines G hétérotrimériques n'a pas non plus aidé à la modulation du signal BRET. Nous avons ensuite tenté de créer un senseur indirect de l'activité de la PI3Ky en mesurant par BRET les interactions entre les sous-unités de PI3K et des protéines G (décrites dans la littérature) lors de l'activation de la PI3Ky. Étonnamment, les résultats révèlent une pré-association basale entre les sous-unités de la PI3Ky et celles des protéines G mais sans détection de modulation significative de signal BRET après stimulation. En conclusion, nous n'avons pu établir un biosenseur BRET de l'activité de la PI3Ky en mesurant les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques. Ainsi, l'absence de modulations détectables du signal BRET après stimulation entre les deux sous-unités pré-complexées pourrait rendre compte d'un mécanisme d'activation impliquant des changements conformationnels plutôt qu'une association-dissociation physique. Dans le futur, l'étiquetage intramoléculaire des sous-unités C ou R avec les deux sondes BRET pourrait peut-être mieux détecter ces conformations et l'activité de la PI3Ky. D'un point de vue fondamental, l'existence de pré-complexes PI3Ky-protéines G pourraient également rendre compte d'une régulation spatio-temporelle plus fine et spécifique de la kinase, en accord avec les récents concepts de modules de signalisation préformés.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Galés, Céline
Senard, Jean-Michel
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (I2MC), INSERM UMR 1048
Mots-clés libres :BRET - Phosphoinosited-3-kinase - Cardiotoxicité
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :13 Jan 2017 18:15