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Halladjian, Maral. Etude de la fonction de l'hélicase Prp43 dans la synthèse des ribosomes et des connexions entre synthèse et maturation du pré-ARN ribosomique chez la levure

Halladjian, Maral (2017). Etude de la fonction de l'hélicase Prp43 dans la synthèse des ribosomes et des connexions entre synthèse et maturation du pré-ARN ribosomique chez la levure.

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Résumé en francais

Dans les cellules eucaryotes, la biogenèse des ribosomes débute par la transcription des unités répétées d'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (Pol I). Ce processus génère un transcrit primaire (pré-ARNr), qui contient les séquences correspondant aux ARNr matures 18S, 5.8S et 25S. Le quatrième ARNr (5S) est transcrit indépendamment par Pol III. Le pré-ARNr s'associe de manière co-transcriptionnelle avec des protéines ribosomiques et de nombreux facteurs de maturation pour former une grande particule pré-ribosomique précoce appelée " particule 90S ". Cette particule précoce subit des étapes complexes de maturation générant les particules pré-40S et pré-60S à l'origine des deux sous-unités ribosomiques matures. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en l'étude de l'hétérodimère Rpf2-Rrs1 chez la levure. Cet hétérodimère est connu pour son rôle essentiel dans le recrutement au sein des pré-ribosomes de la RNP 5S, une particule contenant l'ARNr 5S associé aux protéines ribosomiques RpL5 et RpL11. Nous avons révélé que Rpf2 et Rrs1 interagissent avec la chromatine de l'ADNr par des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) et que cette interaction ne dépend pas de l'intégrité des particules pré-ribosomiques. De plus, Rpf2 et Rrs1 interagissent avec des sous-unités de la Pol I et avec plusieurs facteurs associés à la chromatine de l'ADNr in vivo. Ces données suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 est impliqué dans la régulation de la transcription Pol I en plus de sa fonction dans l'assemblage des pré-ribosomes. Nous avons observé par des expériences d'étalements de Miller que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 est corrélée avec de fortes perturbations dans l'organisation des unités d'ADNr. Grâce à des expériences de " run-on ", une technique permettant d'évaluer la présence de Pol I actives sur l'ADNr in vivo, j'ai pu montrer par ailleurs que la perte d'expression de Rpf2 et Rrs1 affecte fortement le niveau de transcription Pol I. Des expériences complémentaires suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 semble être présent sur l'ADNr en absence de transcription Pol I et a la capacité d'interagir directement avec l'ARN Pol I purifiée in vitro. Ces résultats suggèrent que le complexe Rpf2-Rrs1 joue un rôle crucial dans la coordination fonctionnelle entre transcription de l'ADNr et assemblage des particules pré-ribosomiques chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de l'hélicase Prp43p. Prp43p est une hélicase à boite DEAH impliquée à la fois dans la synthèse des ribosomes et dans l'épissage des pré-ARNm. Cette hélicase interagit avec des protéines à domaine G-patch qui stimulent son activité enzymatique in vitro par un mécanisme inconnu. Durant ma thèse, nous avons pu montrer que l'activation de Prp43 par des protéines à domaine G-patch semble être en lien avec le mode unique de liaison de l'ATP par cette famille d'hélicases. Des données structurales indiquent que la base purique de la molécule d'ATP est empilée entre l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1 et la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 dans le site actif de Prp43. L'étude in vitro d'un mutant de Prp43 portant une substitution du résidu F357 en alanine (F357A), nous a permis de montrer que l'absence de l'empilement de la base de l'ATP avec le résidu F357 découple les activités ATPase et hélicase de Prp43. En revanche, la substitution du résidu R159 en alanine affecte à la fois les activités ATPase et hélicase de l'enzyme. Nous avons observé par ailleurs que le mutant R159A induit le même phénotype que celui résultant de l'absence de la protéine Gno1, un des partenaires à domaine G-patch de Prp43. Ce résultat suggère fortement que les défauts de maturation observés en l'absence de Gno1 résultent d'un défaut d'activation de l'activité hélicase de Prp43. Ainsi l'empilement de la base nucléotidique entre les résidus F357 et R159 parait important pour l'activité et la régulation de cette famille d'hélicases.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Henry, Yves
Henras, Anthony
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote (LBME), UMR 5099
Mots-clés libres :Ribosome - Transcription - ARN Pol. I - Rpf2 - Rrs1 - Prp43
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :27 Mar 2018 14:18