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Le Scornet, Alexandre. Déterminants moléculaires pour un clivage ciblé et efficace par la RNase Y chez Staphylococcus aureus

Le Scornet, Alexandre (2020). Déterminants moléculaires pour un clivage ciblé et efficace par la RNase Y chez Staphylococcus aureus.

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Résumé en francais

Staphylococcus aureus est un pathogène opportuniste et l'un des premiers agent responsable d'infection nosocomiales défini comme pathogène de haute priorité pour le développement de nouveaux antibiotiques. Afin de réguler de nombreux processus cellulaires comme le passage d'agent commensale à pathogène agressif, S. aureus nécessite une régulation génique précise qui ne peut être atteinte que si la demi-vie des ARN est maintenue à une durée courte, généralement comprise entre 1 et 5 minutes. Chez les Firmicutes comme B. subtilis et S. aureus, l'une des enzymes clés de la dégradation des ARN est la RNase Y, une endoribonucléase associée à la membrane. Une délétion de la RNase Y entraine une détérioration de la virulence chez le modèle de bactériémie murin. Notre équipe a précédemment identifié 99 sites de clivage de la RNase Y dans le transcriptome de S. aureus grâce à une méthode nouvellement développée appelée Exact Mapping of Transcriptome Ends (EMOTE). L'analyse des séquences primaires de ces 99 sites de clivage de la RNase Y a révélé une préférence (mais pas une exigence stricte) de clivage immédiatement après une guanosine, menant à la conclusion que d'autres facteurs en plus de la séquence primaire jouent un rôle crucial dans la reconnaissance et le clivage par la RNase Y. Ceci fut confirmé par une étude montrant qu'une structure secondaire en aval du site de clivage est nécessaire au clivage par la RNase Y de l'ARNm saePQRS. De façon intéressante, plusieurs sites de clivage de la RNase Y de S. aureus ont été identifiés comme conservés chez B. subtilis, suggérant un avantage évolutif fort à maintenir des sites de clivage aussi spécifiques. Parmi ceux-ci on trouve notamment l'opéron gapR et glnR. L'objectif de ma thèse est d'identifier les éléments minimums et suffisants pour permettre à la RNase Y de cliver un ARN. Dans le but d'étudier les mécanismes de spécificité de la RNase Y, des cibles conservées au cours de l'évolution tels que l'opéron gapR et glnR ont été utilisés comme modèles afin de déterminer les facteurs essentiels du clivage par la RNase Y. Des vecteurs exprimant les transcrits gapR et glnR de S. aureus et B. subtilis (nos cibles modèles) ont été élaborés puis introduits dans une souche sauvage et délétée pour la RNase Y. L'étude de ces cibles montre un chevauchement fonctionnel entre la RNase Y de S. aureus et B. subtilis et surligne l'importance de la séquence nucléotidique de l'ARN dans le processus de ciblage de l'enzyme. Dans le but de déterminer les facteurs ribonucléiques importants pour un clivage RNase Y dépendant, des mutations ont été effectuées dans la construction gapR et glnR. Les conséquences de ces mutations ont été étudiées par EMOTE. Des délétions ont été effectuées afin d'identifier itérativement les régions importantes pour le clivage par la RNase Y. L'analyse de 25 mutants montre que trois régions sont nécessaires au clivage par la RNase Y du transcrit gapR, une région en amont du site de clivage et deux régions en aval du site de clivage. De manière intéressante, l'une des deux régions en aval est prédite bio-informatiquement comme formant une tige-boucle. Des mutations dans cette région confirment l'importance de cette tige-boucle pour un ciblage précis par la RNase Y et révèle également qu'un clivage efficace nécessite la tige boucle ainsi que des séquences plus distantes (~20 nucléotides plus loin). Des travaux récents identifient un complexe de trois protéines (YmcA, YlbF and YaaT) nommé le Y-complex comme étant nécessaire pour le clivage RNase Y dépendant de 21 cibles sur 22 identifiées chez B. subtilis. Le clivage indépendant a été suggéré comme étant un cas exceptionnel dû à la forte expression de la cible. Un EMOTE effectué sur une souche Delta ymcA a permis d'identifier l'importance du Y-complex chez S. aureus. Les résultats montrent qu'au moins 7 clivages RNase Y dépendants ne nécessitent pas YmcA, confirmant l'existence de deux systèmes d'identification de cible de la RNase Y.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Redder, Peter
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaires (LMGM), UMR 5100
Mots-clés libres :Staphylococcus aureus - ARN - Endoribonucléase - Spécificité
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :26 Feb 2021 12:41