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Germier, Thomas. Dynamique de la chromatine et transcription

Germier, Thomas (2018). Dynamique de la chromatine et transcription.

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Résumé en francais

La dynamique de la chromatine est affectée par les processus biologiques. Pour comprendre comment la physique de la chromatine et la biologie se repondent, nous avons besoin d'outils pour analyser la dynamique de la chromatine in vivo. Plusieurs systèmes existent pour marquer les loci d'ADN et déterminer efficacement leur position dans le noyau, mais ils présentent des inconvénients dans les cellules de mammifères lorsqu'il s'agit d'étudier le mouvement de la chromatine dans le contexte de processus biologiques. Cela est particulièrement vrai lorsqu'il s'agit de mécanismes où l'ADN doit être lu à proximité du marquage. Pour étudier la dynamique de la chromatine in cellulo, l'équipe Bystricky a développé ANCHOR. ANCHOR repose sur l'insertion d'une séquence courte et non répétitive (ANCH) dans le génome de l'hôte. Cette séquence contient des sites de liaison pour une protéine (OR) qui, une fois liée, s'oligomérise et permet la visualisation du locus marqué. ANCHOR est dérivé des systèmes de partitionnement des chromosomes bactériens. L'outil a été implémenté avec succès dans la levure bourgeonnante (Saad et al. 2014) et plus récemment dans la drosophile (H. Chen, Fujioka, et Gregor 2017 ; Gomez-Lamarca et al. 2018). L'un de mes projets de thèse consistait à appliquer le système ANCHOR dans des cellules humaines. La séquence ANCH3 a été insérée de manière aléatoire et en une seule copie dans le génome de la lignée cellulaire de cancer du sein MCF7 par Hafida Sellou (étudiante en M2) et Fatima Moutahir (technicienne). Pour insérer la séquence ANCH3, les cellules MCF7 ont d'abord été modifiées pour insérer un site FRT dans le génome. Ensuite, un plasmide contenant l'ANCH3 couplé au transgène Cyclin D1 et un site FRT a été transfecté. La recombinaison entre les deux sites FRT a été favorisée par la Flipase. La protéine OR3 étiquetée par fluorescence a été exprimée de manière stable ou transitoire pour permettre l'imagerie du gène CCND1 (voir (Germier et al. 2017, 2018) pour plus de détails). Nous avons voulu établir une preuve de principe pour l'utilisation d'ANCHOR dans des cellules de mammifères. Des cellules MCF7 contenant un transgène CCND1, appelé G7-CCND1 (Germier et al. 2017) ont été transfectées de manière stable avec OR3-Santaka et le locus CCND1 a été suivi sur 24 heures à travers une division cellulaire. Nous avons pu suivre efficacement le locus du transgène sans photoblanchiment. La présence de la protéine OR3-Santaka sur le locus chromatinien n'a pas perturbé la réplication et deux loci ont été effectivement observés dans les deux cellules filles (Germier et al. 2018). En utilisant le système ANCHOR3, nous avons donc développé un outil puissant pour étudier à la fois des événements rapides et courts comme la transcription et des événements à long terme se déroulant sur plusieurs jours, comme la division ou la différenciation cellulaire.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Bystricky, Kerstin
Kocanova, Silvia
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote (LBME), UMR 5099
Mots-clés libres :Chromatine - Transcription - Microscopie
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :20 Jan 2022 09:27