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Pillemont, Lyne. Un laboratoire sur puce pour la séparation et la qualification des vésicules extracellulaires

Pillemont, Lyne (2021). Un laboratoire sur puce pour la séparation et la qualification des vésicules extracellulaires.

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Résumé en francais

Les vésicules extracellulaires (ou EVs) sont des sous-espèces cellulaires, de tailles nanométriques et hétérogènes, libérées par toutes les cellules de l'organisme. Elles circulent librement dans les fluides biologiques et sont aujourd'hui considérées comme de potentiels marqueurs et indicateurs de nombreuses maladies. Ainsi, les identifier et les caractériser reste un défi majeur qui pourrait conduire à des diagnostics et pronostics rapides de nombreuses pathologies. Cependant, de par leurs tailles hétérogènes, aucune technique actuelle ne permet de bien les quantifier et les caractériser. Ainsi, seule une combinaison de technologies pourrait permettre de fournir des informations importantes sur ces espèces d'intérêts. Dans ce but, ce travail de thèse a pour objectif de développer un laboratoire sur puce qui permettrait d'isoler les EVs à partir d'un fluide biologique. Le laboratoire sur puce est basé sur un principe de filtration hydrodynamique permettant la séparation des EVs provenant de milieux complexes. Ce principe permet de séparer les particules selon une taille définie. Il s'agit d'une méthode simple et passive (aucun champ extérieur), robuste et moins sujette au risque de colmatage. Son principe est basé sur l'exclusion en taille des particules dont le diamètre est supérieur à une valeur définie, appelée le rayon de coupure, définie par le rapport des débits entre une canalisation principale et une ou plusieurs canalisations latérales. En choisissant judicieusement les dimensions des canalisations, il a été possible de concevoir plusieurs dispositifs permettant la séparation à un rayon de coupure donné. Nous avons conçu et fabriqué, des puces microfluidiques permettant la séparation des particules à un rayon de coupure adapté à l'application des EVs (entre 150 et 900 nm). Nous avons utilisé une technique originale basée sur le laminage successif de films secs (DF) et la photolithographie. Nous avons fait la preuve de concept à l'aide de trois nanoparticules biofonctionnalisées fluorescentes (NP 140-CAS, N 480-OVA et NP 920) couvrant la gamme de distribution des EVs. Une fois la validation faite dans des milieux synthétiques, nous avons décidé de complexifier les mélanges et nous avons injecté des milieux biologiques associés à de nanoparticules dans les dispositifs de tri. Une fois les différentes séparations effectuées, nous avons pu quantifier et analyser à l'aide de différentes techniques (par Tunable Resistive Pulse Sensing, par cytométrie de flux, par comptage directe) nos échantillons. Nous avons démontré qu'à l'aide de nos dispositifs, nous pouvons récolter 35 µL d'échantillon filtré en 30 minutes d'injection ce qui est hautement compatible avec les exigences de l'analyse de quantification. Nous avons comparé chaque échantillon filtré avec ceux injectés et nous avons observé des concentrations identiques pour les nanoparticules de taille inférieure (NP 140-CAS, NP 480-OVA) au rayon de coupure, nous indiquant un rendement de 100 % de récupération. Pour les autres nanoparticules (NP 920) et les grosses cellules présentes dans les milieux biologiques (globules rouges, blancs, etc...) nous avons obtenu un rendement de filtration de l'ordre de 96 à 98%. Nous démontrons ainsi que l'utilisation de fluide biologique (sang, plasma, PPL), n'affecte en aucun cas les résultats de séparation. Ceci prouve que cette méthode de séparation est un bon candidat pour le traitement des échantillons naturels et pourrait être la base d'une nouvelle génération de tests diagnostiques.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Gué, Anne-Marie
Ecole doctorale:Génie électrique, électronique, télécommunications (GEET)
laboratoire/Unité de recherche :Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (LAAS) - CNRS
Mots-clés libres :Vésicules extracellulaires - Microfluidique - Filtration hydrodynamique - Tri cellulaire - Film sec
Sujets :Physique
Déposé le :20 May 2022 15:06