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Le Guyader, Laurent. Utilisation de sondes pyréniques in vivo pour caractériser l'état de phase global de la membrane plasmique de cellules eucaryotes. Application à la détection de la liaison d'agonistes au récepteur delta opioïde murin.

Le Guyader, Laurent (2007). Utilisation de sondes pyréniques in vivo pour caractériser l'état de phase global de la membrane plasmique de cellules eucaryotes. Application à la détection de la liaison d'agonistes au récepteur delta opioïde murin.

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Résumé en francais

Le développement d'outils de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste, antagoniste...) est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG) dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation). L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur ??opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3?-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3?-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène ont permis de mettre en évidence un comportement auto-associatif du cholestérol dépendant du degré de saturation des chaînes acyles. De plus ces sondes sont plus idéalement miscibles dans les phases lo. Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie de la perturbation de phase induite par un agoniste.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Le Roux, Christophe
Lopez, André
Ecole doctorale:Sciences de la matière (SdM)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), INSERM U858
Mots-clés libres :organisation latérale membranaire - pyrène - spectroscopie de fluorescence et d'absorption - cholestérol - membranes plasmique et modèles - lipides - RCPG - cellules - phase liquide-ordonnée
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :14 Dec 2007 14:59