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Paganin-Gioanni, Aurélie. Imagerie de fluorescence d'événements moléculaires et cellulaires associés au cancer au sein d'animaux vivants

Paganin-Gioanni, Aurélie (2009). Imagerie de fluorescence d'événements moléculaires et cellulaires associés au cancer au sein d'animaux vivants.

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Résumé en francais

L'imagerie de fluorescence permet de réaliser le suivi spatiotemporel d'événements fluorescents définis dans le temps et l'espace à l'échelle de la cellule, du tissu ou de l'animal vivant. Le développement de son utilisation pour la détection de cellules cancéreuses repose en partie sur la définition de sondes permettant à la fois le ciblage et la détection. Le premier axe de mon travail de thèse concerne donc le développement de sondes fluorescentes pour le diagnostique de cellules cancéreuses in vivo. Ensuite, le second axe repose sur l'étude du transfert de molécules thérapeutiques in vitro et in vivo dans des cellules tumorales par électroperméabilisation. Dans un premier temps, l'objectif est de développer une molécule " intelligente " pour la détection de cellules cancéreuses dans un organisme vivant par imagerie de fluorescence non invasive. Notre stratégie repose sur l'utilisation de molécules organiques branchées appelées dendrimères, qui peuvent porter plusieurs fonctions permettant le ciblage et la détection. En collaboration avec l'équipe du Dr Majoral, nous avons donc tenté de greffer plusieurs marqueurs tumoraux et plusieurs fluorochromes afin d'augmenter respectivement sa spécificité pour les cellules cancéreuses B16F10 et le rapport signal/bruit pour leur détection in vivo. Malheureusement, la nature chimique des dendrimères n'a pas permis d'obtenir une molécule fonctionnelle. En effet, ceux ci n'étant solubles qu'en présence d'une quantité élevée de solvant organique, nous avons rencontré des problèmes de dénaturation des sondes biologiques (anticorps) que nous tentions de greffer. En parallèle, différents dendrimères (cationiques, anioniques, neutres, fluorescents) non fonctionnels ont été testés sur nos cellules afin de déterminer le meilleur candidat utilisable in vivo. Des problèmes de stabilité de la fluorescence et de toxicité ont été mis en évidence. Pour résoudre ces problèmes, nous avons enfin élaboré avec l'équipe de chimistes, des dendrimères portant des polyéthylènes glycol pour les solubiliser en milieu aqueux et les rendre biocompatibles. Ces derniers n'étant pas cytotoxiques, cette approche permettra d'élaborer un dendrimère fonctionnalisable en milieu aqueux. Les ARN interférents présentent un intérêt majeur pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses car une fois transférés dans le cytoplasme des cellules, ils régulent spécifiquement l'expression d'un gène cible. Cependant, la membrane plasmique des cellules est une barrière imperméable et ses molécules thérapeutiques ont besoin d'atteindre leur cible intracellulaire pour être activent. L'objectif de ce second axe de recherche est d'étudier par imagerie de fluorescence, le mécanisme biophysique qui régit le transfert de siRNA, lorsqu'on électroperméabilise des cellules cancéreuses in vitro et in vivo. Pour cela, nous utilisons un siRNA portant un fluorochrome et dont la séquence nucléotidique cible l'ARN messager de la protéine GFP qui est exprimée constitutivement et de façon stable dans notre modèle cellulaire. Ces travaux montrent que l'électrotransfert du siRNA induit une régulation transitoire du gène ciblé in vitro et in vivo. Grâce à l'imagerie confocale et à l'échelle de la cellule unique, il apparaît que le siRNA traverse librement la membrane plasmique des cellules, sans interagir avec elle (comme le fait l'ADN plasmidique), uniquement en présence d'un champ électrique perméabilisant, et qu'il est transféré dans le cytoplasme des cellules par un mécanisme d'électrophorèse. Enfin, sa biodistribution dans les tumeurs chez le petit animal par des techniques d'imagerie de fluorescence est déterminée. Nos résultats obtenus in vitro et in vivo sont concordants, nous observons une localisation cytoplasmique du siRNA qui permet une régulation transitoire de l'expression du gène cible efficace pendant 6 jours. Nous montrons que l'électroperméabilisation permet un traitement local, homogène et efficace dans les cellules tumorales.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Golzio, Muriel
Teissie, Justin
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
Mots-clés libres :Imagerie - Electroperméabilisation - Fluorescence - Thérapie anti-cancéreuse - Cancer - Dendrimère - SiRNA
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :19 Mar 2010 15:44