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Britton, Sébastien. Les protéines de jonction d'extrémités non homologues : nouvelles fonctions et connexions

Britton, Sébastien (2009) Les protéines de jonction d'extrémités non homologues : nouvelles fonctions et connexions.

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Résumé en francais

Les Cassures Double-Brin de l'ADN (CDB) sont des lésions particulièrement toxiques dans les cellules humaines. Cette toxicité est exploitée pour tuer les cellules tumorales par radiothérapie. Chez l'homme, la voie majeure de réparation des CDB est la Jonction d'Extrémités Non-Homologues (NHEJ). Les protéines centrales de la NHEJ appartiennent à deux complexes : (i) le complexe DNA-PK qui assure la reconnaissance des CDB, composé de KU et de la sous-unité catalytique DNA-PKcs qui possède une activité sérine/thréonine kinase ; (ii) le complexe de ligature permettant la religature finale des deux extrémités de la CDB, composé de Cernunnos/XLF, XRCC4 et de l'ADN LIGASE IV. A ces protéines s'ajoutent des facteurs auxiliaires de maturation des extrémités, telle que ARTEMIS. Mes travaux de thèse répondent à deux objectifs : 1- caractériser de nouvelles fonctions pour les protéines de NHEJ et 2- établir une connexion de ces protéines avec de nouvelles protéines participant à la réponse cellulaire aux CDB. Ainsi, j'ai pu mettre en évidence que le facteur de transcription c-MYC était dégradé en réponse aux CDB. Cette dégradation est dépendante du protéasome et de l'activité de la DNA-PKcs. Elle pourrait contribuer, comme l'accumulation de p53 en réponse aux dommages, à l'arrêt de la croissance et de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, je me suis attaché à caractériser la fonction des phosphorylations de la protéine XRCC4 en réponse aux CDB. Dix sites de phosphorylation in cellulo et induits par les CDB ont été identifiés par spectrométrie de masse (SM). Des anticorps phosphospécifiques ont été établis et les sites mutés sur XRCC4. Ces outils ont permis d'identifier les kinases responsables et de mettre en évidence un état de phosphorylation de XRCC4 apparaissant dès de faibles quantités de CDB. Cet état persiste après réparation des CDB, ouvrant des perspectives d'applications. Pour remplacer facilement la protéine XRCC4 endogène par les mutants, un nouveau vecteur a été développé, le pCASE. Ces outils devraient permettre d'identifier à court terme le rôle de ces phosphorylations. J'ai également pu identifier un nouveau substrat in cellulo de la DNA-PKcs, la protéine de matrice nucléaire SAF-A / hnRNP U. Le site de phosphorylation a été identifié par SM et l'utilisation d'un anticorps phosphospécifique a permis de montrer : (i) que la phosphorylation de ce site est strictement dépendante de la DNA-PKcs et (ii) qu'elle constitue un marqueur de la capacité cellulaire à réparer les CDB. La dynamique de SAF-A sur les CDB a ensuite été analysée en temps réel. De façon inattendue, SAF-A est recrutée transitoirement sur les CDB avant d'être exclue de la zone endommagée. Les déterminants de cette dynamique ont pu être identifiés mais sa fonction reste à établir. Enfin, j'ai analysé le comportement des protéines de la NHEJ au cours de l'apoptose. J'ai ainsi pu montrer qu'elles se mobilisent sur la chromatine au cours de l'apoptose, en particulier ARTEMIS. J'ai pu identifier les déterminants de cette mobilisation et montrer qu'ARTEMIS participe à la fragmentation de l'ADN. En particulier ARTEMIS contribue à la génération des fragments de haut-poids moléculaire notamment en participant au clivage de la région d'attachement à la matrice nucléaire du gène MLL. Mes travaux contribuent à étendre les connaissances sur les protéines de NHEJ et ouvrent des perspectives d'applications : nouveaux marqueurs prédictifs de la réponse aux agents clastogènes et nouvelles cibles pour radiosensibiliser les cellules tumorales.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Calsou, Patrick
Salles, Bernard
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), UMR 5089
Mots-clés libres :Réparation de l'ADN - DNA-PKcs - XRCC4 - ARTEMIS - SAF-A - hnRNP U - Apoptosis - Phosphorylation - Cancer - Translocations - Applications
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :19 Feb 2010 14:40