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Marcheix, Bertrand. Mise au point d'un modèle d'étude de la maladie vasculaire du greffon

Marcheix, Bertrand (2010). Mise au point d'un modèle d'étude de la maladie vasculaire du greffon.

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Résumé en francais

Situation du sujet : En dépit des progrès réalisés en matière d'immunosuppression, la maladie vasculaire chronique (MVC) reste la première cause de perte du greffon après un an. Les modèles expérimentaux apparaissent indispensables pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Les modèles classiques sont limités par des difficultés de transposition des résultats à des situations cliniques chez l'homme. Objectif : Le but de ce travail était de développer un modèle d'étude original de la MVC. Il s'agissait de reconstituer de façon reproductible un conflit allogénique humain in vivo, chez des souris immunodéficientes. La mise au point de ce modèle supposait la réalisation de 4 étapes intermédiaires : 1. La mise en place d'un protocole de prélèvement à fins scientifiques chez les donneurs d'organes. 2. Le développement d'une technique assurant une humanisation reproductible de souris immuno- déficientes. 3. La mise au point d'une technique chirurgicale de greffe du segment artériel mésentérique humain chez la souris. 4. La mise en évidence de lésions de RVC dans le groupe de souris greffées humanisées en combinaison allogénique et l'absence de lésions dans le groupe contrôle isogénique. Matériels et méthodes : Un protocole de prélèvement de tissus humains chez les donneurs d'organes a été mis en place, à l'échelle régionale après avis favorables de l'Etablissement Français des Greffes et du Comité d'Ethique du CHU de Toulouse. Des souris SCID/Beige déficientes pour l'immunité T, B et NK ont été utilisées après vérification de l'absence d'immunité résiduelle (caractère " leaky "). Une première partie de ce travail a consisté à la mise au point du protocole d'humanisation : Des souris ont été réparties en 5 groupes recevant 5 à 100 millions de splénocytes humains et en 2 groupes recevant 5 ou 10 millions de cellules médullaires. Un prélèvement sanguin hebdomadaire permettait un typage des cellules humaines circulantes par cytométrie en flux, et dosage des IgG humaines par technique ELISA. Après sacrifice, les organes lymphoïdes étaient examinés en immunohistochimie et en cytométrie en flux à la recherche de cellules humaines. Dans une deuxième partie du travail, des souris SCID/Beige (non " leaky ") ont subi la greffe d'un segment d'artère mésentérique humaine issue de donneurs d'organes. Cinq à huit greffes ont été réalisées dans les 48 heures suivant chaque prélèvement multi organes. Le greffon était anastomosé en position aortique sous rénale selon la technique d'anastomose " sleeve ". Pour 6 souris, la greffe a été associée à une humanisation en combinaison isogénique, pour 12 souris en combinaison allogénique. Á titre de contrôle, des souris non " leaky " ont été greffées sans humanisation associée (n=4). Des souris " leaky " ont par ailleurs été greffées (n=4). La reconstitution d'un système immunitaire humain était suivie de la même façon que pour les souris simplement humanisées. Les souris étaient sacrifiées après 5 semaines. Le greffon était analysé en histologie, en immunohistochimie et en histomorphométrie. Résultats : Soixante et onze souris ont été humanisées, avec un suivi moyen de 80,8 jours (+/-22,4). L'injection de splénocytes a permis d'obtenir une humanisation des souris SCID/Beige avec présence de cellules circulantes T (CD3+) et B (CD19+). Une synthèse d'IgG humaine a été mise en évidence. La dose optimale de splénocyte nous a semblé être comprise entre 30 à 40 millions de cellules. A cette dose, plus de 80% des souris injectées ont présenté une reconstitution des populations lymphocytaires circulantes. Cependant, cette reconstitution nous a semblé transitoire : elle s'atténuait après 4 à 6 semaines. Une reconstitution stable et prolongée n'a été mise en évidence que dans 13% des cas. L'injection de plus de 40 millions de cellules a été associée à une surmortalité. L'injection de cellules médullaires n'a pas permis de produire une reconstitution significative des populations lymphocytaires. Trente neuf souris ont été greffées, à partir de 8 donneurs différents. Le taux de mortalité per-opératoire a été de 12,8%, le taux de thrombose précoce de 15,4%. Les durées d'ischémie froide n'étaient pas significativement différentes entre les groupes. Pour les groupes iso- et allogénique, les taux de lymphocytes T et B et d'immunoglobulines humains n'étaient pas significativement différents entre les groupes. Les souris non " leaky " non humanisées n'ont développé aucune lésion. Les souris du groupe allogénique ont développé des lésions typiques de MVC. Les souris du groupe isogénique ont présenté un épaississement intimal modéré, et significativement moins important que dans le groupe des allogreffes. Conclusion : La mise en place d'un protocole de prélèvement de tissus humains à fins scientifiques chez les donneurs d'organes nous a permis d'obtenir à la fois des greffons vasculaires et des cellules humaines utilisables chez la souris. Greffons et cellules humaines étaient disponibles en grand nombre et systématiquement typés. Il a été possible de reconstituer des populations lymphocytaires T et B humaines chez la souris SCID/Beige, à partir de splénocytes injectés par voie intra-péritonéale. La reconstitution a été limitée à une période de 4 à 6 semaines. Il a été possible de transposer la technique " Sleeve " à la greffe de collatérales d'artère mésentérique supérieure humaine, dont le calibre était exactement superposable à celui de l'aorte de souris. Des lésions typiques de MVC ont été observées dans le groupe des allogreffes. Un épaississement intimal modéré, dont le mécanisme reste a préciser, a été observé dans le groupe des isogreffes. Au total, la greffe de segments artériels mésentériques humains chez la souris SCID/Beige humanisée nous semble être un modèle original d'étude du rejet vasculaire chronique. Ce modèle offre de nombreuses perspectives parmi lesquelles l'étude du rôle du système immunitaire humoral dans le développement des lésions de RVC, l'évaluation de différentes solutions de perfusion ou de conservation ou encore l'évaluation préclinique, in vivo, de nouvelles thérapeutiques immunosuppressives ou immunomodulatrices.

Sous la direction du :
Directeur de thèse
Salvayre, Robert
Thomsen, Mogens
Ecole doctorale:Biologie, santé, biotechnologies (BSB)
laboratoire/Unité de recherche :Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil (I2MR), INSERM U858
Mots-clés libres :Maladie vasculaire du greffon - Rejet chronique - Souris SCID/Beige - Cellules spléniques/Rate - Artère mésentérique - Transplantation - Greffe
Sujets :Sciences du vivant
Déposé le :15 Nov 2010 17:11